PCR, polimerasaren kate-erreakzioa da, DNA polimerasaren katalisiaren azpian dNTP, Mg2+, luzapen-faktoreak eta anplifikazio-hobekuntza-faktoreak gehitzeari egiten dion erreferentzia, DNA gurasoa txantiloi gisa eta abiarazte espezifikoak luzapenaren abiapuntu gisa erabiliz, Desnaturalizazio, annealing, luzapen eta abarren urratsen bidez, in vitro kate alabaren DNA erreplikatzeko prozesuak, kate nagusiaren DNA txantiloiaren osagarria den, azkar eta zehazki anplifikatu dezake edozein xede DNA in vitro.
1. Hot Start PCR
PCR konbentzionalean anplifikazioaren hasiera-ordua ez da PCR makina PCR makinan jartzea, eta gero programa anplifikatzen hasten da.Sistemaren konfigurazioa amaitzen denean, anplifikazioa hasten da, eta horrek anplifikazio ez-espezifikoa eragin dezake, eta hot-start PCR-k arazo hau konpondu dezake.
Zer da Hot Start PCR?Erreakzio-sistema prestatu ondoren, entzimaren modifikatzailea tenperatura altuan askatzen da (normalean 90 °C baino handiagoan) erreakzioaren hasierako berokuntza-etapan edo "bero-hasieran" fasean, DNA polimerasa aktibatu dadin.Aktibazio-denbora eta tenperatura zehatza DNA polimerasaren eta abiarazte beroaren modifikatzailearen izaeraren araberakoa da.Metodo honek batez ere modifikatzaileak erabiltzen ditu, hala nola antigorputzak, afinitate-ligandoak edo modifikatzaile kimikoak DNA polimerasaren jarduera inhibitzeko.DNA polimerasaren jarduera giro-tenperaturan inhibitzen denez, hots start teknologiak erosotasun handia ematen du PCR erreakzio-sistema anitz giro-tenperaturan prestatzeko, PCR erreakzioen espezifikotasunari uko egin gabe.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse transcription PCR) mRNAtik cDNAra alderantzizko transkripzioa egiteko eta anplifikaziorako txantiloi gisa erabiltzen duen teknika esperimentala da.Prozedura esperimentala ehunetan edo zeluletan RNA osoa ateratzea da lehenik, Oligo (dT) abiarazle gisa erabiltzea, alderantzizko transkriptasa erabiltzea cDNA sintetizatzeko eta, ondoren, cDNA erabiltzea PCR anplifikaziorako txantiloi gisa xede genea lortzeko edo geneen adierazpena detektatzeko.
3. PCR kuantitatibo fluoreszentea
PCR kuantitatibo fluoreszentea (Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR) PCR erreakzio-sistemari talde fluoreszenteak gehitzeko metodoari egiten dio erreferentzia, seinale fluoreszenteen metaketa erabiliz PCR prozesu osoa denbora errealean kontrolatzeko eta, azkenik, kurba estandarra erabiliz txantiloia kuantitatiboki aztertzeko.Ohiko qPCR metodoak SYBR Green I eta TaqMan dira.
4. PCR habiatua
Habiaratutako PCR PCR abiarazleen bi multzo erabiltzeari esaten zaio PCR anplifikazioaren bi txandatarako, eta bigarren txandako anplifikazio-produktua xede genearen zatia da.
Lehen parearen (kanpoko abiarazleak) bat ez datozenak produktu ez-espezifiko bat anplifikatzea eragiten badu, bigarren adar-pareak eskualde ez-espezifiko bera ezagutzeko eta anplifikatzen jarraitzeko aukera oso txikia da, beraz, Bigarren abiarazte bikotearen anplifikazioa, PCRren espezifikotasuna hobetu da.PCR bi txanda egitearen abantaila bat hasierako DNA mugatuaren produktu nahikoa handitzen laguntzen duela da.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR PCR erreakzioaren espezifikotasuna hobetzeko metodo bat da, PCR zikloaren parametroak egokituz.
Touchdown PCR-n, lehen zikloetako errekuzitze-tenperatura abiarazteen gehienezko errezifratze-tenperaturatik (Tm) gradu batzuk baino gehiago ezartzen da.Anplifikazio ez-espezifikoa modu eraginkorrean murrizteko tenperatura altuagoak, baina, aldi berean, erretiro tenperatura handiagoak abiarazteen eta helburu-sekuentzien bereizketa areagotu egingo du, eta ondorioz, PCR etekin murriztuko da.Hori dela eta, lehenengo zikloetan, normalean errekostatzeko tenperatura ziklo bakoitzeko 1°C gutxitzeko ezartzen da, xede-genearen edukia sisteman handitzeko.Errekuzimendu-tenperatura tenperatura optimora jaisten denean, errekuzitzeko tenperatura mantentzen da gainerako zikloetan.
6. Zuzeneko PCR
Direct PCR xede-DNA lagintik zuzenean anplifikatzeari egiten zaio erreferentzia, azido nukleikoen isolamendu eta arazteko beharrik gabe.
Bi zuzeneko PCR mota daude:
zuzeneko metodoa: hartu lagin kopuru txiki bat eta gehitu zuzenean PCR Master Mix-era PCR identifikatzeko;
cracking metodoa: lagina lagin ondoren, gehitu lisatuari, genoma askatzeko lisatu, lisatutako gainditzaile kopuru txiki bat hartu eta PCR Master Mix-era gehitu, PCR identifikazioa egin.Planteamendu honek lan-fluxu esperimentala sinplifikatzen du, denbora praktikoa murrizten du eta DNA galtzea saihesten du arazketa-urratsetan.
7. SOE PCR
Gainjartze-estensioaren bidezko gene-splicing PCR-k (SOE PCR) mutur osagarriak dituzten abiarazleak erabiltzen ditu PCR produktuak gainjarritako kateak osatzeko, eta, beraz, ondorengo anplifikazio-erreakzioan, gainjarritako kateen luzapenaren bidez, zati anplifikatuak gainjarri diren A teknikaren iturri desberdinak. eta elkarrekin elkartuta.Gaur egun teknologia honek bi aplikazio norabide nagusi ditu: fusio-geneen eraikuntza;gene-guneak zuzendutako mutazioa.
8. IPCR
Alderantzizko PCR-k (IPCR) alderantzizko abiarazle osagarriak erabiltzen ditu bi abiarazteez beste DNA zatiak anplifikatzeko, eta DNA zati ezagun baten bi aldeetan sekuentzia ezezagunak anplifikatzen ditu.
IPCR jatorriz ondoko eskualde ezezagunen sekuentzia zehazteko diseinatu zen, eta gehienbat gene sustatzaileen sekuentziak aztertzeko erabiltzen da;berrantolaketa kromosomiko onkogenikoak, hala nola geneen fusioa, translokazioa eta transposizioa;eta gene birikoen integrazioa, gaur egun ere erabili ohi dira Guneari zuzendutako mutagenesirako, kopiatu plasmido bat nahi den mutazioarekin.
9. dPCR
Digital PCR (dPCR) azido nukleikoen molekulen kuantifikazio absoluturako teknika bat da.
Gaur egun hiru metodo daude azido nukleikoen molekulak kuantifikatzeko.Fotometria azido nukleikoen molekulen xurgazioan oinarritzen da;denbora errealeko PCR fluoreszente kuantitatiboa (Real Time PCR) Ct balioan oinarritzen da, eta Ct balioa detektatu daitekeen fluoreszentzia-balioari dagokion ziklo-zenbakiari dagokio;PCR digitala azido nukleikoak zenbatzeko molekula bakarreko PCR metodoan oinarritutako azken teknologia kuantitatiboa da. Metodo kuantitatibo absolutua da.
Argitalpenaren ordua: 2023-06-13