Ultrairagazte zentrifuga-hodiaren erabilera eta neurriak
1) Aukeratu ultrairagazte-hodi egoki bat.Kontuan izan UF mintzak hainbat produktu kimikoekiko tolerantzia mailan desberdinak direla.Normalean, 10 kDa-ko pisu molekularra duten ultrafiltrazio-hodiak hauta daitezke interes molekularraren pisu molekularraren 1 / 3 baino handiagoa izan behar ez duen pisu molekularra, adibidez, 35 kDa.Intereseko proteinaren pisu molekularra 10 kd ingurukoa bada, 3 KD-ko pisu molekularra duen ultrairagazte-hodi bat erabil daiteke.
(2) Ultrairagazkia, erosi berria, lehorra da, erabili aurretik ur ultrapurua gehituta eta ura guztiz igarota mintzatik, izotz-bainutik edo hozkailutik aurrez hoztuta minutu batzuetan.Ondoren, ura botatzen da, hau da, proteina-likidoa, eta zenbat gehitzen den, hodiaren goiko lerro zuria baino gehiago ez dena.Eragiketa arina da, eta ultrairagazte-hodia izotz gainean hoztu behar da proteina-soluzioa gehitu aurretik.
3) Masa zein grabitate-zentroa orekara iritsiko ziren.Kontuan izan biraketa-abiadura eta azelerazioa ez direla oso azkarrak, bestela ultrafiltrazio-mintza zuzenean kaltetuz.Ultrairagazte zentrifugoa hasi zen (4 gradutara aurrez hoztutako zentrifugatzailea).Zentrifugatzaile ezberdinen RPM g bihurtu ondoren, ezberdina zen.Zentrifugatzailearen azelerazioa minimora egokitu zen, mintzaren gaineko presioa murriztuz.Kontuan izan, ziurtatu zentrifugatzailea irteten duzula zentrifugatzaileak helmugako abiadura lortu ondoren, edo arazoren bat baduzu, ezin duzu lehen aldiz kudeatu.Mintza ardatzarekiko orientazioa argibideen arabera egokitu zen (zentrifugagailu angeluarra da mintzarekiko ardatz perpendikularra).Erabilera praktikoan, biraketa-abiadura orokorra argibideetakoa baino txikiagoa da, zentrifugatzailearen hodiaren bizitza luzatu ahal izateko.
3) Masa zein grabitate-zentroa orekara iritsiko ziren.Kontuan izan biraketa-abiadura eta azelerazioa ez direla oso azkarrak, bestela ultrafiltrazio-mintza zuzenean kaltetuz.Ultrairagazte zentrifugoa hasi zen (4 gradutara aurrez hoztutako zentrifugatzailea).Zentrifugatzaile ezberdinen RPM g bihurtu ondoren, ezberdina zen.Zentrifugatzailearen azelerazioa minimora egokitu zen, mintzaren gaineko presioa murriztuz.Kontuan izan, ziurtatu zentrifugatzailea irteten duzula zentrifugatzaileak helmugako abiadura lortu ondoren, edo arazoren bat baduzu, ezin duzu lehen aldiz kudeatu.Mintza ardatzarekiko orientazioa argibideen arabera egokitu zen (zentrifugagailu angeluarra da mintzarekiko ardatz perpendikularra).Erabilera praktikoan, biraketa-abiadura orokorra argibideetakoa baino txikiagoa da, zentrifugatzailearen hodiaren bizitza luzatu ahal izateko.
(4) Gainerako 1 ml-ra kontzentratuta, hartu 50 ul soluzio tampone, gehitu 10 ul-ko fluxua eta ikusi kolore urdinik dagoen, ultrairagazte-hodiari proteina falta zaion epai gisa.Hodia ihesik badago, berriro bota goiko geruza eta hodi berri batera isuri ultrairagazkia hasteko.Hodiak galdu ote ziren zehatz-mehatz zehazteko, zentrifugatu 10 minutuz 5 mgml BSArekin fluxua egin aurretik, proteina-kolan exekutatu edo Bradford-en saiakuntza gordinarekin, eta jarraitu gainerako proteina-soluzio kontzentratua gehituz (izotzean funtzionatzen duena eta proteinak berotzea eragozten duena) arte. kontzentratu guztia gehitu da.Kontuz ibili zentrifugazioan proteinen prezipitazioa gertatzen bada, hodiak ixtea eraginez.Prezipitazioa gertatzen bada, zehaztu prezipitazioaren kausa espezifikoa gehiegizko proteina-kontzentrazioa edo buffer desegokia den;Lehenengoa aldi berean ultrairagazte-hodi anitzen ultrairagazketaren bidez ebatzi daiteke, kontzentrazioa gutxituz, eta bigarrena tampon-disoluzio desberdinak trukatuz proteinaren prezipitaziorik gertatu ez arte.
(4) Gainerako 1 ml-ra kontzentratuta, hartu 50 ul soluzio tampone, gehitu 10 ul-ko fluxua eta ikusi kolore urdinik dagoen, ultrairagazte-hodiari proteina falta zaion epai gisa.Hodia ihesik badago, berriro bota goiko geruza eta hodi berri batera isuri ultrairagazkia hasteko.Hodiak galdu ote ziren zehatz-mehatz zehazteko, zentrifugatu 10 minutuz 5 mgml BSArekin fluxua egin aurretik, proteina-kolan exekutatu edo Bradford-en saiakuntza gordinarekin, eta jarraitu gainerako proteina-soluzio kontzentratua gehituz (izotzean funtzionatzen duena eta proteinak berotzea eragozten duena) arte. kontzentratu guztia gehitu da.Kontuz ibili zentrifugazioan proteinen prezipitazioa gertatzen bada, hodiak ixtea eraginez.Prezipitazioa gertatzen bada, zehaztu prezipitazioaren kausa espezifikoa gehiegizko proteina-kontzentrazioa edo buffer desegokia den;Lehenengoa aldi berean ultrairagazte-hodi anitzen ultrairagazketaren bidez ebatzi daiteke, kontzentrazioa gutxituz, eta bigarrena tampon-disoluzio desberdinak trukatuz proteinaren prezipitaziorik gertatu ez arte.
(5) Lehen urratsak proteina kontzentratzeko erabiltzen dira, eta buffera aldatu nahi bada, gehitu astiro-astiro buffer berria (ultrafiltrazioa 0,22 um ultrafiltrazio mintz baten bidez) proteina osoaren 1 ml ingurura, eta birkontzentratu 1 ml inguru hirutan. ondoz ondoko aldiz, azken bolumena kontzentratua nahi den proteina-kontzentrazioaren araberakoa izanik, oro har, 500 ul baino gehiagokoa, baina baita 200 ul-ra ere.Lortu 1000 × edo gehiago hiru alditan, funtsean, adina buffer-aldaketa, aldi bakoitzean gutxienez 10 × edo bolumen aberastearekin kalkulatzen den bezala.
(5) Lehen urratsak proteina kontzentratzeko erabiltzen dira, eta buffera aldatu nahi bada, gehitu astiro-astiro buffer berria (ultrafiltrazioa 0,22 um ultrafiltrazio mintz baten bidez) proteina osoaren 1 ml ingurura, eta birkontzentratu 1 ml inguru hirutan. ondoz ondoko aldiz, azken bolumena kontzentratua nahi den proteina-kontzentrazioaren araberakoa izanik, oro har, 500 ul baino gehiagokoa, baina baita 200 ul-ra ere.Lortu 1000 × edo gehiago hiru alditan, funtsean, adina buffer-aldaketa, aldi bakoitzean gutxienez 10 × edo bolumen aberastearekin kalkulatzen den bezala.
Argitalpenaren ordua: 2022-11-09